| 四、实验室鉴定方法
(一)试验样品 品种纯度测定的送验样品的最小重量应符合规定。
(二)种子形态特征鉴定
1．重要性和局限性 这是品种鉴定最常用的简单易行的方法。如果两个品种在种子形态特征方面存在可靠的遗传差异，那么就很容易地加以区分。但是种子形态特征方面可供鉴别的性状有限。有的品种之间没有明显和可靠的差异，那么就不可能用该法进行鉴别。
2．鉴定品种的依据 鉴定品种是根据种子形态特征方面的差异。不同种类种子可根据下述种子形态特征的差异进行鉴别。如水稻种子根据谷粒形状、长宽比、大小、稃壳和稃尖色、稃毛长短、稀密、柱头夹持率等；大小麦外稃基部形状，籽粒颜色、形状，腹沟基刺、腹沟宽，小穗轴绒毛多少，外稃侧背脉纹齿状突起，稃外皱折，鳞被形状及绒毛稀密。豆类根据种子颜色、大小、形状、光泽、蜡质，种脐形状及颜色。棉花则依据籽色、籽形和短绒密度分析品种真实性和纯度。陆地棉绿色籽、日晒呈棕色；而稀毛籽、畸形籽、多毛大白粒和光籽为杂籽，白籽、灰白籽为正常籽。海岛棉绿色籽，光籽为正常籽，而灰白籽、畸形籽则是为杂籽。玉米种子形态特征如种子粒形(圆粒、扁粒、长粒)、类型(马齿型、半马齿形、．硬粒型)、颜色(白、浅黄、黄、橙黄、浅红、紫色)，种子大小、果柄颜色(红、白、浅红、紫红)、顶部凹陷和饱满状况，胚的大小和形状，籽粒表面圆滑程度、棱角的有无、颜色和花丝遗迹等区别不同品种及利用胚乳直感鉴定父母本与杂交种，确定品种纯度。其中利用胚乳直感现象鉴定杂交种与父母本有明显颜色差异的亲本自交系粒是很有效的。如8112譎21、黄早4譓ol7Ht、107谆圃缢牡茸楹暇褪墙虾玫睦印Ｈ?112譎21组合中母本籽粒顶端黄色，父本白色、杂交种为白色据此可将母本自交系粒和杂交种区分；107顶为黄色，胚乳橘红色，父本黄早四顶为白色，同样杂交种顶为白色，胚乳为橘红色，可明显地将杂交种与母本自交系区分；黄早四譓ol7Ht的母本黄早四籽粒黄色透明，父本红黄色不透明，杂交种红黄色不透明，因此也可区分杂交种及母本自交粒。
3．鉴定方法 随机从送验样品中数取400粒种子，鉴定时须设重复，每个重复不超过100粒种子。
根据种子的形态特征，必要时可借助扩大镜等进行逐粒观察，必须备有标准样品或鉴定图片和有关资料。
鉴定时，对种子进行逐粒仔细观察鉴定，区分出本品种和异品种种子，计数，并按下列公式计算品种纯度百分率。
品种纯度=（检种子数-异品种种子数）/检种子数?00％
4.查对容许差距 良种品种纯度是否达到国家种子质量标准、合同和标签的要求，可利用表进行判别。
杂交水稻国家种子质量标准规定品种纯度为99．O％。从表6—14第1行查到规定值99％，然后从样本株数，苗数或种子粒数栏到样品400的行，即容许差距为O．8％，本抽检品种纯度98．75％比标准规定值仅低O．25％，小于容许差距O．8％，表明这批杂交水稻种子是合格的。
表中品种纯度测定的容许差距，可通过下列公式计算：
T(容许差距)=1．65p'q／N
式中：P=标准规定纯度(％)；
q=100-P
N=种植株数或样品数量
例如：某一作物，国家标准规定纯度99％，试验样品400粒种子，则q=100-99=1；T=1．65（99*1/400）=0．8
特别所用试样数量不是表中的定数时，用上述公式计算容许差距就更方便了。
(三)快速鉴定 目前国际上通常把化学鉴定和物理鉴定合称为快速鉴定。
1．化学鉴定 该法主要根据不同品种皮壳成分和化学物质的差异，而对不同化学试剂反应显色的差异来鉴定品种。
(1)苯酚染色法 苯酚又名石炭酸，其染色的原理是单酚、双酚、多酚在酚酶的作用下氧化成为黑色素(C77H98O55N14S)，由于每个品种皮壳内酚酶活性不同，将苯酚氧化呈现深浅不同的褐色。该法主要适用于小麦、水稻和牧草。此法已列入ISTA品种鉴定手册。
①小麦。有两种方法。国际种子检验规程采用的苯酚染色法为取试样二份，各100粒，浸于清水中24h，取出置于1％石炭酸湿润的滤纸上，经4h(室温)，鉴定种子染色深浅。通常分五级：不染色、淡褐色、褐色、深褐色、黑色。将与基本颜色不同的种子作为异品种，计算品种纯度。另外一种快速的方法是将小麦种子在1％石炭酸液中浸泡15min，倒去药液，将种子腹沟向下置于苯酚湿润过的纸间盖上培养皿盖，置30～40℃培养箱l~2h，根据染色深浅进行鉴定。
②水稻。取试样二份，各100粒，先浸于清水中6h，倒去清水注入1％苯酚溶液，浸12h，取出用清水冲洗，放在吸水纸上经一昼夜，鉴定种子染色程度，谷粒染色分五级：不染色、淡茶褐色、茶褐色、深茶褐色、黑色。此法可以鉴别籼粳稻，一般籼稻染色深，粳稻不染色或染成浅色深，因籼、粳型不同品种染色均有深浅之分。但有一点可以肯定，凡不染色者均属粳稻。
③早熟禾。取试样二份，各100粒浸人水中18~24h，取出置于1％饱和的苯酚纸间4h，并进行一次观察，到24h再进行第二次观察与对照标准样比较颜色(一般分浅褐、褐色和深褐色)进行鉴定。
(2)愈创木酚(C7H8O2)法 其原理是大豆种皮内具有过氧化物酶，能使对过氧化氢分解而放出氧，使愈创木酚氧化而产生红棕色的4-邻甲氧基酚，由于不同品种过氧化物酶的活性不同，溶液颜色也有深浅之分。鉴定方法：取大豆种子二份，各50粒，剥下每粒种皮，分别放入小试管内，加入蒸馏水2ml，于30℃浸种1h，使酶活化，然后滴人O．5％的愈创木酚10滴，经10min，加O．1％的双氧水1滴，经数秒后溶液即呈现颜色立即鉴定。溶液可分无色、淡红色、橘红色、深红色、棕红等不同等级，可根据不同颜色鉴别本品种和异品种，并计算纯度百分率。
(3)碱液(NaOH或KOH)处理 可用于十字花科种子真实性鉴定。取试样二份，各100粒，将每粒种子放人直径为8mm的小试管中，每管加入10％NaOH 3滴，于25~28℃放置2h，然后取出鉴定浸出液颜色。如结球甘蓝为樱桃色，花椰菜为樱桃至玫瑰色，抱子甘蓝、皱叶甘蓝为浓茶色，油菜、芥菜、芸薹为浅黄色，芜菁为淡色至白色，饲用芜菁为淡绿色。
(4)草木樨硫酸四氨铜鉴定 将3g硫酸铜加入盛有30ml的氢氧化铵(NH4OH含量为4．8g)溶液瓶中成饱和液(有沉淀)，再继续加硫酸铜少量成沉淀为止。低温避光贮存备用。将其试样种子用硫酸四氨铜液浸种20min，种皮呈橄榄色或黄绿色为白花草樨，种皮呈深褐色至黑色为黄花草木樨。
(5)小麦种子的氢氧化钠显色法 当小麦种子红白皮不易区分(尤其是经杀菌剂处理的种子)时，可用氢氧化钠测定法加以区别。数取400粒或更多的种子，先用95％(V／V)甲醇浸泡15min，然后让种子干燥30min，在室温下将种子浸泡在5mol／L NaOH溶液中5min，然后将种子移至培养皿内，不可加盖，让其在室温下干燥，根据种子浅色和深色加以计数。
AOSA替换方法：数取试样100粒，4次重复，分别放入9cm玻璃培养皿里，每个培养皿分别加入20mL 5％和10％氢氧化钠溶液(m／V)，摇晃，使药液淹没种子。经30或60min后观察鉴定。一般红皮小麦呈现棕红色，而白皮小麦呈黄色，然后，计数和计算红皮或白皮小麦百分率。
2．物理鉴定 目前应用较广泛的物理鉴定法是荧光分析法。其原理是根据不同品种种子和幼苗含有荧光物质的差异，利用紫外线照射物体后有激发光的现象，将不可见的短光波转变为可见的长光波。由于光的持久性不同可分成两种类型：一种叫荧光现象，紫外光连续照射后物体能发光，当停止照射时，被激发的光也随着停止。另一种叫磷光现象，当紫外光停止照射后，被激发生成的光在或长或短时期内可继续发光。这里主要应用荧光法鉴定品种。因不同品种和类型的种子，其种皮结构和化学成分不同，在紫外光照射下发出荧光也不同。鉴定的方法有两种：
(1)种子鉴定法 取试样4份，各100粒，分别排列在黑纸上，放于波长为365nm的紫外分析灯下照射，试样距灯泡最好为10～15cm，照射数分钟后即可观察，根据发出的荧光鉴别品种或类型。如蔬菜豌豆发出淡蓝或粉红色荧光；谷实豌豆发褐色荧光；白皮燕麦发淡蓝色荧光；黄皮燕麦发暗色或褐色荧光；无根茎冰草发淡蓝色荧光；伏枝冰草(有害杂草)发褐色荧光。十字花科不同种发出荧光不同：白菜为绿色，萝卜为浅蓝绿色，白芥为鲜红色，黑芥为深蓝色，田芥菜为鲜蓝色。
(2)幼苗鉴定法 国际上主要用于黑麦草与多花黑麦草的鉴别。取试样二份，各100粒置于无荧光的白色滤纸上发芽，粒与粒之间保持一定距离，于20℃恒温或20～30℃变温培养。黑暗或漫射光，发芽床保持湿润，经14d即可鉴定，将培养皿移到紫外灯下照射，凡黑麦草根迹不发光，多花黑麦草则根迹发蓝色荧光。羊茅与紫羊茅也可用同样的方法进行鉴定。但幼苗鉴定前发芽床上先用稀氨液喷雾，然后置于紫外灯下照射，羊茅的根发蓝绿色荧光而紫羊茅则发黄绿色荧光。
(四)幼苗形态鉴定 在温室或培养箱中，提供植株以加速发育的条件(类似田间小区鉴定，只是所需时间较短)，当幼苗达到适宜评价的发育阶段时，对全部或部分幼苗进行鉴定；另一种途径是让植株生长在特殊的逆境条件下，测定不同品种对逆境的不同反应来鉴别不同品种。
1．利用幼苗芽鞘颜色等标记性状鉴别真假杂种 利用双亲和一代杂种在苗期表现的某些植物学性状，如幼苗芽鞘颜色的差异，在苗期可以准确地鉴别出杂种和亲本苗(假杂种)，这种容易目测的性状称为“标记性状”或“指示性状”。
利用该法进行鉴别真假杂种，杂种带有苗期隐性性状，而父本带有相应的显性性状，这样杂交所得的杂种表现显性方可与其母本区别。同时该性状还是不易受环境条件影响，最好是一对基因控制的质量性状，如果是数量性状则双亲差异应该是很大的。
禾谷类幼苗芽鞘通常分绿色与紫色两类，因品种不同；紫色有深浅之分。如水稻IR24芽鞘为绿色，献党1号芽鞘为紫色，杂种(F1)赣化2号则为浅紫色。鉴定时取试样4份，各100粒，在适宜温度和连续光照下培养发芽，待芽鞘露出品种固有颜色时就可鉴定，凡紫鞘中出现绿鞘幼苗时则为异品种，计算品种纯度。为使花青素加深可在较低的温度下发芽或用1％盐酸湿润发芽床。
2．根据子叶与第一片真叶形态鉴定十字花科的种或变种 在子叶期根据子叶大小、形状颜色、厚度、光泽、茸毛等性状鉴别。第一真叶期根据第一真叶形状、大小、颜色、光泽、茸毛、叶脉宽狭及颜色、叶缘特征鉴别。也可通过控制环境条件，诱导幼苗显现出品种之间遗传特性的差异。
鉴定方法，取试样4份，各100粒，将种子播于水分适宜的砂盘内，粒距1cm．，于20～25℃培养，出苗后置于有充足阳光的室内培养，发芽7d后鉴定子叶性状。10～12d鉴定真叶未展开时性状。15～20d鉴定第一真叶性状。甘蓝各变种第一真叶的形状。
3．根据第一片真叶叶缘特性鉴定西瓜纯度 南京农业大学1995年用营养液砂培(粒距3cm，温度20～30℃)置于充足光照条件下，发芽12d第一片真叶展开时根据叶缘有无缺刻，缺刻深浅成功地鉴别了几个杂交组合的西瓜品种纯度。
4.玉米幼苗形态鉴定 根据杂种优势原理和质量性状遗传理论，将被检验种子进行恒温箱(30℃)发芽，观察测定幼苗的生长势和质量性状，以鉴定种子纯度。在已知品种前题下区别自交系与杂种较为可靠，如玉米中单2号与自交系M017幼苗性状的区别。
5.大豆幼苗形态鉴定 把种子播于砂中(种子间隔2．5cm?．5era，播种深度2．5cm)，在25℃下培养，24h光照，每隔4d施加Hoaglandl号培养液*，至幼苗各种特征表现明显时，根据幼苗下胚轴颜色(生长10～14d)、茸毛颜色(21 d)、茸毛在胚轴上着生的角度(21 d)、小叶形状(21 d)等进行鉴定。
6．莴苣幼苗形态鉴定 将莴苣种子播在砂中(种子间隔1．0cm?．0cm，播种深度1cm)，在25℃恒温下培养，每隔4d施加Hoaglandl号培养液，3周后(长有3～4片叶)根据下胚轴颜色、叶色、叶片卷曲程度和子叶等形状进行鉴别。
7．甜菜幼苗形态鉴定 有些栽培品种可根据幼苗颜色(白色、黄色、暗红色或红色)来区别。将种球播在培养皿湿砂上，置于温室的柔和日光下，经7d后，检查幼苗下胚轴的颜色。根据白色与暗红色幼苗的比例，可在一定程度上表明糖用甜菜及白色饲料甜菜栽培品种的真实性。
(五)电泳鉴定
1．应用电泳鉴定品种的理论基础 电泳在品种鉴定中的成功开发应用是基于蛋白质可作为对编码的结构基因的标记。因此，个体或群体间蛋白质成分的差异，就成为基因表达的根本差异。由于基因是与遗传特征相联系的，所以蛋白质标志能用以标记这些特征。这种特征体系是一套基因，或是部分染色体，或是整条染色体，或是完整的基因组。通过分析足够多的蛋白质标志可以涉及大量的基因组。由于作物品种是由各种不同遗传表现的种质集合体所组成，所以对这些集合体中的特种蛋白质或酶的成分进行比较就能用来表示或描述这些材料的特征。电泳方法提供了一种进行这种比较的绝好方法。这种有效的方法是基于各品种蛋白质的多态性，即以多种不同的分子形式存在。对于品种和种子工作的研究人员倾向于种子蛋白质的电泳检查。但是，对鉴定来说，最有用的是贮藏蛋白质。几乎所有作物中，种子贮藏蛋白质电荷数量或颗粒大小或两项同时具有相当大的多态性。而且它们在许多位点上被编码，以较大数量存在，并能方便地提取。因此，种子贮藏蛋白质成分给电泳检查提供了一种表征植物基因型的有效而简便的方法，对品种鉴定是非常有用的。另一种类似的方法是采用特殊染色剂揭示某种酶的多种分子形式(同工酶)。与贮藏蛋白一起，组织提取物一般可直接用于同工酶分析。已知许多植物的酶都以多种形式存在且已有许多特殊染色剂。此外，一些作物中许多酶的遗传控制都已明确。因此，在大多数作物中不难找到种子蛋白或同工酶的适宜的蛋白质标志，以用于农作物品种鉴定。
2．种子蛋白质和同工酶的种类及常用电泳方法
(1)蛋白质的分类和电泳方法 目前种子蛋白质的命名主要是根据T．B．Osborne的分类，按种子蛋白质不同溶解特性进行分类，则可将蛋白质分为如下4种类型：
①清蛋白。这种蛋白质能溶于水，包括大多数酶蛋白。通常可用同工酶电泳方法进行鉴定。
②球蛋白。这种蛋白质能溶于稀盐溶液，主要存在于膜结合的蛋白体中。严格概念上它也称为贮藏蛋白。目前，我国应用最多的玉米种子盐溶蛋白电泳鉴定就是对球蛋白进行品种鉴定。
③醇溶蛋白。这种蛋白质能溶于醇类水溶液。也是贮藏蛋白。目前国际上和ISTA广泛应用的小麦和大麦种子醇溶蛋白电泳，就是利用这种蛋白进行品种电泳鉴定。
④谷蛋白。这种蛋白质能溶于稀碱和稀酸溶液中。主要为结构蛋白。目前应用的核酸电泳就是对这种蛋白进行品种和遗传鉴定。
上述4种蛋白质的氨基酸成分特征特性方面均表现不同，而且在不同种子中其各种蛋白质类型的比例在不同植物种之间也有差异。例如，在小麦、大麦、玉米、黑麦等谷类种子含有较高比例的醇溶谷蛋白，而在另一些禾谷类种子如燕麦、水稻等种子中则以球蛋白为主；豆类种子，如菜豆、豌豆等则含有较高水平的球蛋白为特征。
根据对上述蛋白质电泳分离研究表明，这些种类蛋白质都可有效地用于农作物品种鉴定。
(2)同工酶分类Markert(1978年)把同工酶的分为两类：
①单基因决定同工酶，但其氨基酸序列上存在着差异。如水稻幼苗芽鞘颜色控制的酯酶同工酶。
②后成同工酶，这种酶在翻译后再经修饰而产生同工酶。
(3)目前鉴定品种的常用电泳方法
①国际种子检验规程(所列入的常用电泳方法1996国际种子检验规程)已将鉴定小麦和大麦品种醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照程序，鉴定豌豆属和黑麦草属的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法、超薄层等电聚焦电泳测定杂交玉米和种子纯度的标准参照方法列入规程，在全世界推广应用。
②国际植物新品种保护联盟的植物新品种DUS检测指南所列入的电泳鉴定方法。该组织于1994年制订有关电泳技术标准将分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦B-和C-醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法列入DUS检测应用。
③我国农作物种子检验规程所列入的品种鉴定方法和国内常用电泳方法。我国GB/T3543．1～7-1995农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入。
目前我国各地常用和研究的，较为有效的品种鉴定的电泳方法有：
玉米种子盐溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，其他作物种子的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和同工酶电泳鉴定等方法。
3．电泳图谱的分奚和鉴别
(1)电泳谱带的分类
①根据谱带特征、血缘关系和鉴别方便可将电泳谱带分为如下两类。
a．公共带(共同带)：这是指同种同属的不同品种，由于其起源进化的历史和生态条件相同，具有数目不等的相同的谱带。如能确定哪些是公共带，那么鉴定品种时，可以不要检查鉴定这些谱带，可以简化鉴定手续。
b．特征谱带(指示谱带或标记谱带)：这是指不同品种之间所存在的稳定的可明确鉴别，可靠区分的遗传的谱带，如互补型谱带和杂种型谱带等。如经过若干次电泳，并在不同实验室能重演，能明确可靠地鉴别，那么在鉴定品种时，只要检查鉴别这些谱带就能鉴别品种。
②按杂交种的谱带的特征可将电泳谱带分为四类。
a．互补型谱带：这是指杂交种具有来自母本谱带和父本谱带的一种谱带类型。
b．杂种型谱带：这是指杂交种具有母本和父本所没有的，只有杂种才能具有的新产生的谱带。
c．偏母型谱带：这是指杂交种具有与母本基本相同的谱带。
d．偏父型谱带：这是指杂交种具有与父本基本相同的谱带。
③按电泳迁移的快慢可将电泳谱带分为三类。
a．快带：这是指由于分子较小、形态光滑、电荷较多、在电泳场中泳动最快、跑在前面的谱带。通常用英文字母F表示。
b．慢带:这是指分子较大、形状不规则、带电荷较少、在电泳电场中泳动最慢、留在后面的谱带。通过用英文字母S表示。
c．中带：这是指在电泳电场中泳动时，介在快带与慢带中间、泳动速度中等的谱带。通常用英文字母N表示。
(2)电泳图谱的分区 为了电泳图谱观察鉴定的方便，国内外通常将电泳图谱进行分区。在分区时，可根据图谱中谱带分布和变化差异以及分界情况，进行区分。其分区方向，可从前沿或起点开始分区，区号通常可用希腊文字母、英文字母或罗马数字来表示区号。
(3)电泳图谱的鉴定 不同品种的电泳图谱可按其谱带的数目、Rf值、宽窄、颜色及其深浅等加以鉴别。
①谱带数目。不同品种之间的谱带数目有不同。玉米杂交种丹玉13号具有两条互补型过氧化物酶同工酶谱带，而其母本自交系Mo17Ht和父本E28只有1条特征谱带。
②谱带位置(Rf值)。不同品种的谱带数目可能相同。杂交玉米丹玉13号的父本E28和母本Mo17Ht均具有一条特征谱带，但这条谱带的位置不同，父本28具有Rf值O．202谱带，而母本自交Mo17Ht则具有Rf值O．232谱带，非常容易鉴别。
③谱带的宽窄。从大量研究中发现，电泳图谱中不同品种之间谱带有宽窄之分。
④谱带浓度深浅。从研究中发现，电泳图谱中不同品种之间由于基因的剂量效应，谱带颜色有深浅之分。
⑤谱带颜色。从研究中发现，经显色后电泳图谱中的谱带颜色有差异。如淀粉酶同工酶经显色后。α-淀粉酶显示白色透明条带，β淀粉酶显示粉红色条带，R一淀粉酶显示浅蓝色条带，Q一淀粉酶显示红色或褐色条带。大麦和小麦种子醇溶蛋白电泳谱带的颜色也有天蓝色和带红蓝色的区别。
(4)ISTA杂交玉米标准电泳图谱
4．应用电泳鉴定品种的有关技术
(1)试验样品数量 根据ISTA的《Electrophoresis Handbook》中的4．Statistical Evaluation of Electro pheresis Tests(1992)有关统计表格。
由于自花授粉、常白花授粉和杂交种在遗传上是一致的，这些作物品种的电泳图谱也是非常一致的，因此其品种纯度电泳测定时常用少量种子样品。如ISTA推荐大麦和小麦种子醇溶蛋白鉴定用100粒种子。如作简单的核对，还可以分析50粒种子。
取决于规定种子纯度百分率。在95％的概率下至少能测出1粒非真实种子而应测定的样品种子数。如果测不出非真实种子，就可设想为其真实种子百分率等于或高于各自对应给定的百分率。左栏为给定的品种纯度百分率(％)，右栏为种子数(n)。
(2)电泳测出品种纯度与标准规定纯度的容许差距 品种真实性测定的容许误差，一个估算值与一个规定值，一尾测验，概率为95％时，所有数据均为百分数，n为样品大小(估计值与规定值比较的容许差距)。
(3)电泳图谱的计算机描绘和图谱分析 浙江大学种子科学中心于1995年编制了电泳图谱的计算机描绘程序。该程序使用前，先将测定电泳谱带的Rf值、谱带等级、谱带数字代码，前沿指示剂迁移距离、品种编号登记在电泳图谱登记表上，然后进入该软件操作系统，键人程序命令文件名PAGEEN，只要按程序提示，输入有关信息和数据资料，加以校对，就可驱动打印机，打印出整齐美观的电泳图谱。现已有电泳图谱扫描、分析、计算的新软件。
(六)DNA分子标记指纹图谱鉴定 利用分子标记技术，互接反应DNA水平上的差异，因而成为当今最先进的遗传标记系统。DNA指纹图谱技术主要有限制性片段长度多态性(RestrictiOn fragment length polymorphism，简称RFLp)、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)、小卫星DNA(Minisatellite DNA)、微卫星DNA(Microsate llite DNA)、扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)等。
1．RFLP 是Grodzicker等于1974年发明的。它是一种利用限制性酶切片段长度来检测生物个体之间差异的分子标记技术。RPLP 20世纪80年代开始应用于植物。目前在水稻、小麦、玉米、番茄和马铃薯等作物上的研究都已有报道。但是，RFLP的多态信息含量是相对而言的，在一些作物上RFLP探针可进行品种间及种间的鉴别，而在小麦、马铃薯、大豆等作物上的多态性较低。特别是小麦，由于它是严格的自花授粉作物。基因组较大，多态性很低，因而RFLP在指纹图谱中的应用受到限制。
2．RAPD 是Willams等在1990年发明的，利用扩增DNA片段长度差异来检测生物个体的分子标记技术。它可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行基因组指纹图谱的构建。这种方法相对于RFLP来说比较简便，DNA用量也较少，且省了使用放射性同位素：因而受到了许多学者的重视。welth(1991)曾用RAPD分析玉米杂交种的品种纯度，He等(1992)曾用RAPD识别小麦品种，在花生、小麦、水稻等作物上也曾进行过深入研究。但是RAPD是显性标记，不能区分杂合型和纯合型，更重要的是，RAPD检测受分析条件的影响很大。
3．小卫星DNA 是1980-1984年间由人类遗传学家相继在人体基因组中发现的。它是由长度为11～60bp的核心序列串联重复形成的可达25kb的串联重复序列，主要存在于染色体的近端粒处，在不同个体之间存在有串联数目的差异，因而可产生多态性。多态性的产生可能是在DNA复制或不等交换过程中发生的串联数目的变化引起的。小卫星DNA在真核基因组中具有多等位性、高丰富性和极强的保守性。Jeffreys等(1985)发现人源小卫星探针可以同时与众多的基因组酶切DNA片段杂交，得到具有个体特异性的指纹图谱。
4．微卫星DNA(又称Simple sequence repeat，简称SSR) 是一类由几个核苷酸(一般为1～5个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。同一类的微卫星可分布于整个基因组的不同位置上。每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。这种多态性的信息量是比较高的。
微卫星DNA具有所有RFLP的遗传学优点，且避免了RFLP方法中使用放射性同位素的缺点，又比RAPD重复率和可信度高，因而目前已成为遗传标记中的热点。在植物学上，微卫星DNA已应用于番茄、大豆、水稻、玉米、芸薹属和拟南芥属等许多作物中，通过对微卫星DNA序列的研究，相应产生了使用人工合成的寡核苷酸作探针的方法，这种方法也可检测到大量的多态性。
微卫星DNA是目前极受欢迎的指纹图谱技术，但是由于这种方法必须针对每个染色体座位的微卫星，发现其两端的单拷贝序列才能设计引物，因而给微卫星标记的开发带来了一定困难。这项技术目前在商业上还没有完全应用，仅发现了一些有用的SSR引物。
5．AFLP技术 是1992年由荷兰Keygene公司发明的。AFLP以PCR为基础，实际上是RFLP和PCR相结合的一种方法。其基本原理是通过选择性扩增基因组DNA的酶切片段而产生，多态性选择性扩增是通过在引物的3’末端加上选择性核苷酸而实现的。通过改变选择性核苷酸的数目，就可以预先决定所要扩增的片段的数目。
AFLP可以分析基因组较大的作物，多态性高，重复性强。利用放射性标记在变性的聚丙烯酰胺凝胶上可检测到100～150个扩增产物，因而非常适合于绘制品种的指纹图谱及进行分类研究等工作。AFLP虽然刚产生不久却受到了广泛重视，已应用于大豆、水稻、玉米及棉花等作物上。研究表明．AFLP产生的多态性远远超过了RFLP、RAPD等技术，因而被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。
DNA指纹图谱的最终鉴定必须通过电泳使各种谱带分开，从而达到鉴定品种的目的。由于DNA分子量比蛋白质大得多，因而聚丙烯酰胺凝胶不适合于DNA的电泳分离而多采用琼指糖凝胶进行电泳分离，在限制性内切酶或特异性引物存在的条件下DNA经变性、退火等程序使特异性DNA片段的量增加，从而在琼脂糖凝胶上产生特异谱带。
电泳结束后DNA区带的观察常采用紫外光下的荧光法，因而在凝胶中必须加入荧光染料，常用的荧光染料为溴化乙锭，它用量少染色方法简便，只要在凝胶中滴人微量的溴化乙锭，就可插入核酸的碱基对之间在紫外光照射下发出橙色荧色，但溴化乙锭浓度过高，DNA刚性增加，迁移率下降，一般凝胶中溴化乙锭以O．1---0．5μg／ml为宜。然后通过拍照，可得分子标记图谱，用以品种鉴定之用。
(七)田间小区种植鉴定(Examination of plants on field plots)
1．重要性 田间小区植株鉴定是最为可靠、正确的真实性和品种纯度鉴定的方法。它适用于国际贸易、省。(区)间调种的仲裁检验，并作为赔偿损失的依据。因为品种纯度室内检验时，虽然有多种方法，但往往仍难于准确鉴定；特别对于杂交种(杂交水稻、玉米、高梁、蔬菜、西瓜等)F1代种子更加难于正确鉴定其真实性和纯度。在此种情况下，田间小区鉴定就显得十分必要了，因为田间小区鉴定时，可以根据植株在生育期间的各种特征、特性将不同品种加以鉴别。这对异花受粉作物纯度鉴定尤为重要。
2．标准样品的作用和要求 为了鉴定品种真实性，应在鉴定的各个阶段与标准样品进行比较。对照的标准样品为栽培品种全面的、系统的品种特征特性的现实描述，标准样品应代表品种原有的特征特性，最好是育种家种子。标准样品的数量应足够多，以便能持续使用多年，并在低温干燥条件下贮藏，更换时最好从育种家处获取。
3．土地选择、种植密度和栽培管理措施 为使品种特征特性充分表现，试验的设计和布局上要选择气候环境条件适宜的、土壤均匀、肥力一致、前茬无同类作物和杂草的田块，并有适宜的栽培管理措施。
行间及株间应有足够的距离，大株作物可适当增加行株距，必要时可用点播和点栽。
4．鉴定种植株数 为了测定品种纯度百分率，必须与现行发布实施的国家标准种子质量标准相联系起来。试验设计的种植株数要根据国家标准种子质量标准的要求而定。一般来说，若标准为(N一1)?00％/N，种植株数4N即可获得满意结果。如标准规定纯度为98％，即N为50，种植200株即可达到要求。
5．鉴定时期 许多种在幼苗期就有可能鉴别出品种真实性和纯度，但成熟期(常规种)、花期(杂交种)和食用器官成熟期(蔬菜种)是品种特征特性表现最明显的时期，必须进行鉴定。
6．观察鉴定 检验员应拥有丰富的经验，熟悉被检品种的特征特性，能正确区别植株是属于本品种还是变异株。变异株应是遗传变异，而不是受环境影响所引起的变异。
7．结果计算和表示 将所鉴定的本品种、异品种、异作物和杂草等均以所鉴定植株的百分率表示。
8．品种合格和淘汰的评判 国家标准种子质量标准规定纯度要求很高的种子，如育种家种子、原种，是否符合要求，可利用淘汰值。淘汰值是在考虑种子生产者利益和有较少可能判定失误的基础上，把在一个样本内以观察到的变异株数与质量标准比较，作出接受符合要求的种子批或淘汰该种子批，其可靠程度与样本大小密切相关。
不同规定标准与不同样本大小下的淘汰值，如果变异株大于或等于规定的淘汰值，就应淘汰该种子批。
淘汰值(Reject)的计算，可按下列公式进行：
R=X 1．65√x O．8 1 (计算时舍去小数)
式中X为杂株数。
例如：田间小区种植4000株。标准规定纯度为99．9％，则X(杂株数)=4
R=4 1.65√4 O．8 1=9
9．结果报告 田间小区种植鉴定结果除品种纯度外，可能时还需填报发现的异作物、杂草和其他栽培品种的百分率。
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