二、种子四唑染色法

(一)四唑测定的发展简史 四唑测定于1942年由德国Soealed Hoheneim学校的H．LakOn(莱康)教授发明，第2次世界大战期间传入美国。随着世界四唑测定技术的发展，ISTA于1950年成立四唑测定技术委员会，致力于世界四唑测定技术的发展。 1953年第一次把四唑测定列入国际种子检验规程。ISTA曾先后作了多次重大的修订和补充，不断扩大四唑染色法测定生活力种类和致力于完善测定程序。1974年在波兰华沙会议上又扩大了12属和14个种的林本种子，以及25个属和4个种的农业种子。1983年加拿大渥太华会议上又进一步扩大到64个农业和林木属和种的种子应用。1974年美国R．P．Moore(穆尔)教授被选为ISTA四唑测定技术委员会主席，他为发展和推进四唑测定技术的标准化，着手编写《四唑测定手册》(Handbook OnTetrazolium Test)。其后经1977年马德里和1980年维也纳会议讨论修改，于1983年渥太华会议正式批准定稿，并于1984年由ISTA瑞士秘书处正式公布发行。该手册汇集了全世界最先进和实用的种子四唑测定技术和650多个属和种的农业、蔬菜、林木、牧草、药材和花卉种子的具体测定技术。它是四唑测定技术发展的重要里程牌，是目前世界上四唑测定技术最先进、最完整、最实用、介绍测定种子种类最多的、最为重要的四唑测定参考书。
我国种子四唑测定生活力的应用日益重视，必将逐渐在全国普及应用。
(二)四唑测定的特点 四唑测定具有原理可靠、结果准确、不受休眠限制、方法简便、省时快速、成本低廉等特点。所以四唑测定是世界公认、广泛应用、实用方便、省时快速、结果可靠、深受欢迎、最有发展前途的种子生活力测定方法之一。
(三)四唑测定的适用范围 根据1996国际种子检验规程规定，四唑测定可适用下列方面的快速测定种子生活力：
①测定休眠种子的发芽潜力；
②测定收获后要马上播种种子潜在发芽能力；
③测定发芽缓慢种子的发芽潜力；
④测定发芽末期未发芽种子的生活力；
⑤测定种子收获期间或加工损伤(如热伤、机械损伤、虫蛀、化学伤害等因素)种子生活力，并按染色局部解剖图形查明损伤原因：
⑥解决发芽试验中遇到的问题，查明不正常幼苗产生的原因和杀菌剂处理或种子包衣等的伤害；
⑦查明种子贮藏期间劣变衰老程度，按染色图形分级，评定种子活力水平；
⑧时间紧迫，调种时快速测定种子生活力。
(四)应用的化学试剂 1．四氮唑的理化性质 这种药品首先由H．Lakon应用于种子生活力测定。全称为2，3，5-氯化(或溴化)三苯基四氮唑，简称为四唑或红四唑。英文名为2，3，5-Triphenyl TetrazoliumChloride(Or Bromide)，缩写TTC(TTB)或TZ。分子式为C19H15N4C1，分子量334．8，为白色或淡黄色的粉剂，溶点243℃，易溶于水，具有微毒。但遇到直射光线会被还原成粉红色，因此，该试剂需用棕色瓶装盛，并用黑纸外面包装。同样，已配好的四唑溶液也应装入棕色玻璃瓶里，存放在暗处。在进行种子染色时，也需将其放在暗处和弱光处。这是一种目前全世界普遍采用的四唑盐类。所以通常将四唑测定称为TTC测定(TTC test)，美国称为TZ测定(TZ test)。
目前国际和我国通常采用的是四唑药剂是2，3，5-氯化三苯基四氮唑或2，3，5-溴化三苯基四氮唑。一般建议使用O．1％～1．O％四唑盐的水溶液。切开种子可用0．1％～0．5％浓度的四唑溶液；整个胚、整粒种子或斜切、横切或穿刺的种子需用1．O％浓度的四唑溶液。染色时间与四唑溶液浓度有关。随着四唑溶液浓度的增加，染色反应所需时间也随之缩短。
在四唑测定时，要求四唑水溶液的pH在6～7范围之内。当四唑溶液的pH不在这一范围时，建议采用磷酸缓冲液来配制。其配制方法是称取lg四唑粉剂溶解于100ml磷酸缓冲液中，即配成1．O％浓度的溶液；或者称取O．1g四唑粉剂溶解于100ml、磷酸缓冲液中，即配成0．1％的四唑溶液。当用酸度计测定时，如四唑溶液的pH不在7时，则可用氢氧化钠或碳酸氢钠稀溶液加以调节。所配好的四唑溶液应保存在棕色瓶里，一般有效期可保持数月。如存放在冰箱里，则可保存更长的时间。已用过的四唑溶液应倒掉，不能再用。
2．磷酸缓冲液(Phosphatic buffer solution) 为了保证四唑染色的效果，配制四唑染色溶液时，通常应用磷酸缓冲液来溶解。其配制方法如下：
(1)ISTA TZ手册法 首先配两种母液，然后按比例混和即成：
母液I：称取9．078g磷酸二氢钾(KH2PO4)溶解于1 000ml蒸馏水中；
母液II：称取9．472g磷酸氢二钠(Na2HPO4)或11．876gNa2HPO4?H2O溶解于1 000ml蒸馏水之中。
然后取母液I2份和母液Ⅱ3份混和即成。
(2)AOSA规程法 在1 000ml蒸馏水中加入5．45g磷酸二氢钠和3．79g磷酸氢二钠，充分溶解即成。
3．乳酸苯酚透明液(Iactophenol clearing solution) 这种溶液是用于小粒豆类和牧草种子经四唑染色后使种皮、稃壳或胚乳变为透明，以便透过这些部分清楚地观察其胚主要构造的染色情况。
其配法是取20ml乳酸、20ml苯酚(若苯酚是结晶形式，则需溶化为液体)、40ml甘油和20ml水配成。该药液有毒性，配制时最好戴树胶薄膜手套，并在通风橱里操作。在使用时谨防触及皮肤或衣服等。
4．过氧化氢溶液(hydrogen perocide solution) 该溶液是用于某些牧草种子(如黑麦草和早熟禾等)的预湿浸种，以加快酶的活化和吸胀。一般应用O．3％H2O2溶液。
5．杀茵剂和抗生素(fungicides and antibiotics) 应用微量的杀真菌剂和(或)抗生素加入四唑溶液里或染色样品中，以延缓衰弱种子的劣变进程。可利用O．5％青霉素等抗菌素。但应注意，当使用带有毒性的杀菌剂处理种子时，最好用凡士林、石油胶或其他皮肤保护剂涂抹手指，以防刺激皮肤，或将其刺激降到最低限度。
6．胶液硬化剂(Mucus hardening reagents) 有些种子浸种后，种皮表面出现胶液而变得非常光滑，难以拿牢进行样品准备之则可用硫酸钾铝[AIK(鼢)2?2H20]、醋酸铅[Pb(QH3Q)2。2H20]或硫酸钾(K2S04)、硫酸铝[业(S04)3]、氢氧化铝【4趟(OH)3]等硬化剂。这些药品均能溶解于水。目前硫酸钾、硫酸铝已广泛应用，并且较为有效。
(五)四唑染色测定原理 在生物化学测定中，种子活细胞里发生的还原过程是通过一种指示剂的还原作用而显现出来的。所用的指示剂是一种可被种子组织吸收的四唑盐类的无色溶液。它在种子组织里参与活细胞的还原过程，从脱氢酶接受氢离子，使氯化(或溴化)三苯基四氮唑经过氢化作用，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散的三苯基甲腊(Triphenyl Formazam)，参看下面的反应式。
这样就可根据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色的有生活力部分和无色的死亡部分。除完全染色的有生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，还可能出现一些部分染色的异常颜色或不染色的坏死组织。当然，种子有无生活力主要取决于胚和(或)胚乳(或配子体)坏死组织的部位和面积的大小，而不一定在于颜色的深浅。颜色的差异主要功能是将健全的、衰弱的和死亡的组织判别出来，并确定其染色部位，才有决定意义。
根据以上理由和所用指示剂，把这种测定称为“局部解剖图形的四唑测定”(Topographicaltetrazolium test)。这就是说，可根据种子胚和活营养组织局部解剖染色部位及颜色状况，鉴定种子胚的死亡部分，查明种子死亡的原因。如玉米和小麦种子盾片中部不染色，表明种子是受到热损伤引起的。同样，如种子胚根不染色，表明种子衰老，首先从胚根死亡开始或受热或化学损伤。
(六)四唑测定程序 四唑测定结果的正确性在很大程度上取决于采用方法的适合性、检验人员对有关知识的理解和实际运用能力，以及操作技术的熟练程度等因素。因此，检验人员在全面掌握有关理论和知识后，必须深入了解四唑测定的程序，并掌握熟练的操作技术。这里先将一般四唑测定程序叙述如下。
1．预处理
(1)目的 大部分种子在测定前都需经过预处理。其主要目的是使种子加快和充分吸湿，软化种皮，方便样品准备和促进活组织酶系统的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确性。
(2)预措 预措是指在种子预湿前除去种子外部的附属物。其方法包括剥去果壳和在种子非要害部位弄破种皮，但须注意，不能损伤种子内部胚的主要构造。如水稻种子需脱去稃壳；花生果需剥去果壳；桃种子需剥去木质化的内果皮；冷杉种子需切去种子基尖；朴属种子需切去种子顶端；刺豆属花卉种子需弄破种皮等。
(3)预湿 预湿是四唑染色测定的必要步骤。其预湿方法应根据不同种子生理特性，采用相应而有效的方法。目前常用预湿方法有如下二种：
①快速水浸预湿。这种方法是将种子完全浸入水中，让其充分吸胀。因为种子直接浸入水中，吸水快、吸水均匀，并可缩短预湿时间。这种方法主要适用于种子直接浸入水中不会造成组织破裂的损伤，并不会影响鉴定正确性的种子种类。这些种类包括水稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦草、红豆草、黑麦、玉米、杉属、鹅耳枥属、扁柏属、榛属、枸子属、山楂属、卫矛属、山毛榉属、岑属、苹果属、松属和椴属等。
②缓慢纸床预湿。这种方法是将种子放在纸床上或纸巾间，让其缓慢吸温。这种方法主要适用于有些直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以及衰弱的种子或过分干燥的种子。ISTA规程规定，像大豆、菜豆、葱、花生、李和莎草等种子，通常要求缓慢纸床预湿。但许多禾谷类种子既可水浸预湿，也可缓慢纸床预湿。当然，这类种子也可先进行缓慢吸湿，待胚组织变为柔软后，再放入水中进一步吸胀，以加快吸水速度。
2．样品准备
(1)目的 为了使四唑溶液快速和充分渗入种子的全部活组织，加快染色反应和正确鉴定胚的主要构造，必须按其胚和营养组织的位置和特性，采用适当的方法使胚的主要构造和(或)活的营养组织暴露出来。因此，大多数种子在染色前必须进行样品准备工作。
(2)样品准备方法 样品准备方法取决于种子大小、形状、种皮结构，胚的位置、形状及大小，营养组织的活与死，应用仪器的性能，技术的先进性，测定时间的紧迫性，结果的正确性等要求以及检验人员的工作经验等因素。因此，对每种种子要求选择最适合的方法来制备种子样品。虽然有时采用不同的准备方法均可获得满意的结果，但有些方法则较为麻烦和太花时间。以下介绍有关样品准备的方法。
1不须预湿和附加准备。这是对种皮渗水性良好的小粒豆类而言的。如紫花苜蓿和小扁豆等种子吸水快，在四唑溶液里染色时，就能随着四唑溶液的渗入而吸胀，并在染色后采用透明液使种皮变为透明，也能正确鉴定种子生活力。
2采用缓慢预湿后不须样品准备。这是适用于种皮具有良好透水性的大粒豆类，如菜豆和大豆等。但在染色后观察鉴定前也需剥去种皮，以便观察得更为清楚，鉴定更为可靠。
3穿刺或切开胚乳。这是适用于小粒牧草等种子。如小糠草、早熟禾和梯牧草等种子。小糠草种子很小，通常采用针刺胚乳法，以打开四唑溶液渗入胚的通道。其方法是将已预湿的种子连带吸水纸一起移到四唑工作台上，打开底射灯光，左手拿住3～5倍小放大镜，右手握住细针，针头对准胚乳中心，约离胚1mm处扎下，穿刺胚乳，然后将已针刺的种子放人四唑溶液染色。如梯牧草种子可用单面刀片一头，从其中部半边切人，切出一个缝口，以利四唑溶液的渗入。
4沿胚纵切。这种方法适用于具有直立胚的大粒禾本科等种子。如玉米、麦类和水稻等种子。其方法是通过胚中轴和胚乳，纵向切开，使胚的主要构造暴露出来，取其一半，用于四唑染色。
5近胚纵切。这种方法适用于松柏类和伞形科等具有直立胚的种子。其方法是在靠近胚的旁边纵向切去一边胚乳或胚子体，保持着胚的大半粒种子用于染色。
6上半粒纵切。这种方法适用于莴苣和其他菊科等具有直立胚种子。其方法是通过种子上部2／3处纵向切开，但不能切到胚轴。
7切去种子基端。这种方法适用于茜草科等种子。其方法是横向切去种子的基部尖端，使胚根尖露出，但不要切开种皮，以便保持两个胚连在一起。
8斜切种子。这种方法主要适用于菊科、十字花科和蔷薇科等种子。如棉花、菊苣、山毛榉等胚中轴在种子基部的种子。其方法是从种子的上部中央、下部偏离胚处斜向切入，并将上部大部分切开，以便四唑溶液渗入染色。
9横切胚乳。这种方法主要用于如黑麦草、鸭茅和羊茅等直立胚很小且位于其基部的种子。其方法是在大约离胚lmm的上部，横向切去胚乳，留下带胚的下部种子，供作四唑测定用。但切时应十分注意，带胚一端不能留得太长而延缓四唑溶液渗入胚部；如留下部分长短不齐，则可能引起四唑溶液渗入时间不一致，而引起不同种子染色程度的差异，这就会增加鉴定的困难。为了掌握好横切留下长度一致，即离胚的切面距离一致，最好先用低倍放大镜观察一下胚的位置，并将有胚一端朝前，再在适当位置切下。有时因有的种子很小，更难分清胚所在的一端，就必须用放大镜看清胚的位置后再切，以保证切得正确。
10剥去种皮。该法主要适用于锦葵科(如棉花等)、壳斗科(板栗等)、茶科(茶子等)和旋花科(牵牛花等)种皮较厚且颜色深的种子。其方法是用工具，将预湿后的整个种皮剥去。
11横切胚轴和盾片。该法主要适用于中粒禾本科种子。如小麦和燕麦等。其方法是在种子预湿后用单面刀片横向切去胚的上部，从切面露出胚轴、胚根和盾片等。特别是通常包有稃壳的燕麦种子，这种切法较为方便。
12打开胚乳取出胚。该法适用于很多林木种子。如杜仲等种子，胚完全被胚乳所包围，只有切开或挑开胚乳，才能取出胚。
13从果实内取出胚。该法主要适用于果木和林木种子。如桃，须先剥去木质化的内果皮，再剥去种皮，使胚露出。又如沙枣等种子，须先剥去果肉，洗净，然后挑去种壳，取出胚。
14横切种子两端，切开胚腔。该法适用于山茱萸、胡颓子和肖楠等种子。
15平切果种皮和胚乳，暴露出胚的构造。有些蔬菜和农作物种子，如洋葱、甜菜、菠菜等种子，其胚为螺旋形平卧在胚乳中，只有在扁平方向削去上面一片种皮和胚乳，才能使整个胚的轮廓暴露出来，以便染色和鉴定。
3．四唑染色
(1)目的 其目的是通过染色反应，能将胚和活的营养组织里的健壮、衰弱和死亡部分的差异正确地显现出来，以便进行确切的鉴别，可靠地判断种子生活力和活力。
(2)染色程序 按要求，将经过样品准备或不须准备的规定数量种子分别放入四唑溶液里染色。小粒种子可用6cm培养皿，大、中粒种子可用9cm培养皿或更大的容器。特别细小的种子可包在滤纸内，分别放入容器里，然后加入适宜浓度的四唑溶液，以淹没种子为度，移置一定温度的黑暗恒温箱内或弱光下进行染色反应。因为光线可能使四唑盐类还原而降低其浓度，影响染色效果。
(3)染色的温度和时间 染色时间因种子种类、样品准备方法、本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、pH和温度等因素的不同而有差异。其中特别是温度影响为最大。染色时间可按需要在20～45℃度范围内加以适当选择。在这种温度范围内，温度每增加5℃，其染色时间可减少一半。例如，要求在30℃下适宜染色时间为6h的种子样品，移到35℃下则只需染色反应3h，在40℃下仅需1．5h。另一方面，种子的健壮、衰弱和死亡不同等级的组织，其染色的快慢也是不同的。一般来说，衰弱组织四唑溶液渗入较快，染色也较快；健壮组织酶的活性强，染色明显。为了使这些不同等级的组织均能达到良好的染色程度，以便于鉴别。有时可根据样品的实际情况，适当调整染色时间，即缩短或延长。
如果已到规定染色时间，但样品的染色仍不够充分，这时可适当延长染色时间，以便证实染色不够充分是由于四唑溶液渗入缓慢所引起，还是由于种子本身的缺陷所引起的。但必须注意，染色温度过高或染色时间过长，也会引起种子组织的变质，而可能掩盖住由于遭受冻害、热伤和本身衰弱而呈现不同颜色或异常的情况。
有些种子要求在各重复中加入微量的杀菌剂或抗生素，以避免在染色过程产生带有黑色沉淀物的多泡沫溶液。
4．鉴定前处理 为了确保鉴定结果的正确性，还应将已染色的种子样品，加以适当的处理，再进一步使胚的主要构造和活的营养组织明显地暴露出来，以便观察鉴定和计算，这里将目前国际上采用和有效的处理方法介绍如下。
(1)不须处理，直接观察 适用于染色前已进行样品准备的整个胚、摘出的胚中轴、纵切或横切的胚等样品。因为这些种子胚的主要构造已暴露在外面，所以不须附加处理，就可直接观察鉴定。
(2)轻压出胚，观察鉴定 适用于样品准备时仅切去种子的一部分，胚的大部分仍留在营养组织内的样品。在鉴定前须用解剖针在种子上稍加压力，使胚向切口滑出，以便观察。
(3)扯开营养组织，暴露出胚 适用于染色前样品准备时仅撕去种皮或仅切去部分营养组织的样品。如冷杉等种子。其方法是扯去遮盖住胚的营养组织或弄掉切口表面的营养组织，使胚的主要构造完全暴露出来，以便鉴定。
(4)切去一层营养组织，暴露出胚和活营养组织 适用于样品准备时，仅切去或切开种子上半粒或基部的种子样品。因为这些种子的胚仍被营养组织所包围，所以需在适当的位置切去一层适宜厚度的营养组织，才能看清胚和活营养染色情况。
(5)沿胚中轴纵切，暴露出胚的构造 这种方法适用于样品未准备的种子。如有些豆类种子。
(6)沿种子中线纵切，暴露出胚和活营养组织 这种方法适用于样品准备时，仅除去种子外面构造，或仅切去基部的种子。如五加科等种子。
(7)剥去半透明的种皮或种子组织，暴露出胚 这种方法适用于四唑染色前样品未加准备或仅切去基部的种子。如大豆、豌豆等种子。
(8)切去切面碎片或掰开子叶，暴露出胚 这种处理主要适用于切得不好或有些豆科双子叶种子。如鉴定前发现胚中轴被若干切面碎片所遮盖，以致难以正确鉴定，则需切去一层子叶，或者为了可靠观察子叶之间胚中轴的染色情况，则需掰开子叶。
(9)剥去种皮和残余营养组织，暴露出胚 这种处理适用于在样品准备时仅切去种子一部分的样品。如红花种子在样品准备时，仅切去种子的上部，仍有种皮和残余营养组织包着胚，因此，只有除去这些部分，才能暴露出胚的主要构造。
(10)乳酸苯酚透明液的应用 在四唑染色反应达到适宜时间后，小粒种子用载玻片挡住培养皿口的一边，留下一条狭缝，让其只能沥出四唑溶液，注意不能溜出种子。万一不小心，跑出几粒种子，则可用小吸管吸回种子。对更细小的种子(如小糠草)等，则可用管口比这种种子小的吸管吸去四唑溶液，这样就不会吸进种子而仅吸去溶液。然后用厚型吸水纸片吸干残余的溶液，并把种子集中在培养皿中心凹陷处为一堆，再加入2～4滴乳酸苯酚透明液，适当摇晃，使其与种子良好接触，马上移人38℃恒温箱保持30～60min，经清水漂洗或直接观察。这种有效的透明程序可使果种皮、稃壳或胚乳变为透明，则可清楚地鉴定胚的主要构造的染色情况。
5．观察鉴定 四唑测定样品经染色和样品处理后，进行正确的观察鉴定是十分重要的。测定结果的可靠性取决于检验人员对染色组织和部位的正确识别、工作经验和判断能力等综合运用能力。为了避免判断的错误，检验人员应按鉴定标准，认真观察，以高度的责任感，确保鉴定结果的正确性。
(1)目的 观察鉴定主要着眼于以下三个目的：
①确切计算种子在适宜条件下(包括在杀菌剂处理有效的情况下)能产生正常幼苗的能力，即种子生活力百分率。
②按种子样品染色程度和组织特征，判断其强壮程度，将种子分为强或弱2～3个等级，以便统计种子活力。
③按局部解剖染色图形，观察染色部位，查明种子劣变和生活力丧失的原因，为种子生理、种子加工、种子贮藏和种子处理提供指导情报。
(2)鉴定因素 每个染色样品的鉴定应根据种子染成的颜色、组织状态，有无肿胀、破裂、虫伤、衰弱模糊，以及其他异常情况等鉴定因素作出正确的判断。同时，还应考虑其胚的主要构造机能与其他部分之间的关系，即与营养组织的损伤面积(指不染色的面积)、位置和程度的关系。因为这些部分对胚发育成正常幼苗也是不可缺少的。
同时，还要注意观察种子的健壮水平。这种水平是以染成的颜色、膨胀程度和软腐等状态显现出来的。据此，可将种子分为健壮、活的衰弱组织、死的衰弱组织和死亡等4个等级水平。
(3)胚的组织特征 种子胚组织特征在种子种类之间、预湿温度和时间等因素的不同而可能有所变化。为了便于正确判别，这里将不同健壮水平的组织特征分述如下。
①健壮组织。一般情况，这种组织表现为在暴露的表面颜色正常、均匀一致，无明显的分界、色泽鲜红且有光泽，并且组织状态正常。其湿润的染色组织通常具有高度的膨胀性和弹性。当用解剖针稍压时，表面不会留下压痕。当用针挑出胚根或其他构造时，表现出一定的硬性，并在干燥失水后仍具有均匀一致的收缩特性，保持着正常的色泽。
②衰弱的活组织。这是指已有不同程度劣变的活组织。其劣变程度可从几乎接近健壮到已经衰老而活着的不同衰弱程度。但其染色程度和组织特征是随着劣变的加深和范围大小而呈现出一定的差异。其颜色的异常情况也随着种子劣变程度的增加而加深。如玉米和小麦的胚染色组织，其衰弱活组织切面的颜色要比正常组织略深，呈灰暗红色，并随着暴露时间的增加而变深。
特别要注意，子叶、胚芽鞘和胚根的尖端的劣变症状要比其他部分出现得早。如子叶尖端呈现膨胀纹条或斑点。胚芽鞘和胚根尖端染的颜色很浅或不染色，这就表明这些部分的组织已经劣变或损伤。当让这些部分气干时，较为容易收缩，并且其颜色也变为深红。
③衰弱的死组织。这是指已严重劣变而仍有染色的死组织。有时这种组织往往被健壮或衰弱的活组织所包围或埋藏着，只有切开时，才能观察得到。这种组织颜色杂有斑点，或呈淡紫色、淡棕色、暗红色等不同的变化。当切开胚轴时，其切面已呈现出异常的白色。若再刮去表面的白色层，其下层则为暗红色，并且组织已变为糊状，无膨胀力，切面呈软腐状态，并带有污点。当让其气干时，则很快收缩。
④不染色的死组织。通常死组织是染成很浅而无光泽的红色或灰白色，并且组织软腐、模糊，与活组织有明显的分界。但应注意，当延长染色时间时，其颜色可能会变深，因此绝对不能错误地将其当作活组织。
⑤不同组织的区分。正确区分健壮、衰弱活组织、衰弱死组织和死亡组织对取得可靠的测定结果是十分重要的。这些组织的差异可从颜色、组织状态和分界等特征加以区别。从染成的颜色看，健壮组织是染成有光泽的鲜红色，有光泽的淡红色或有光泽的淡黄白色，衰弱的活组织通常染成稍深的红色，并随着劣变程度的加深，其颜色也随之变化。先在子叶和胚根鞘出现不染色或异常的颜色。衰弱死组织则染成淡紫色、淡红棕色、灰红色，并往往带有斑点。其颜色可从黑色到灰红色等不同等级的变化。死组织则不染色，或略带淡红色、灰白色，并且无光泽。
从组织状态看，健壮组织具有弹性和膨胀感。死组织则缺乏弹性和膨胀感，而且呈软腐和糊状状态。当然也应注意，有些禾本科大粒种子的活组织有时也表现软腐和糊状状态。这可能是由于切开技术不当或暴露在空气后引起的不良反应，但只要叶表面有明显的叶脉，仍应当作活组织。
再从染成颜色的分界线看，健壮组织与衰弱活组织之间没有明显的分界线，但它们与衰弱死组织之间有明显的分界线。当切开组织时，就能看到其内部的正确分界线。
(4)观察鉴定 从上述胚的组织特征分析，已掌握了区分健壮、衰弱和死组织的知识，但在实际鉴定时还应认真考虑下列有关方面。
①胚的主要构造部位及主要细胞分裂区的染色状况和组织状态是否正常。
②正确区分正常与不正常胚组织的染色特征的差异。
③全面观察正常、不正常或死种子的胚及活营养组织的特征及其关系。
④判断引起染色等级不同的原因。
⑤正确识别由于测定技术不当而人为造成的损伤和异常染色情况。
⑥如果全部胚的主要构造的染色和功能均在可接收的正常范围内，那么，即使胚的构造和组织状态有些不正常情况，也不能认为种子已丧失生活力。
(5)几种种子的鉴定标准 为了确切掌握四唑染色样品的鉴定技术，这里介绍几种种子鉴定标准的实例供参考。
一般鉴定原则是，凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组织状态正常的，为有生活力种子。凡是胚的主要构造局部不染色或染成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染色部分已超过1／2，或超过允许范围，以及组织软化的，为不正常种子。凡是完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软腐或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子。
在鉴定时，可借助于放大器具，认真观察鉴别。大、中粒种子可直接用肉眼或5～7倍放大镜进行观察鉴定。对小粒种子最好利用10～100倍体视显微镜进行仔细观察鉴定，在观察时，先打开底射灯光和侧射灯光，开始用低倍(10 x)观察，大致将正常染色种子，每10粒放成一堆，而将异常染色及有怀疑的种子放在一起，然后再用30 x～40 x物镜进行仔细观察核实，最后正确地区分和计算种子生活力或活力。
(七)结果表示与报告 计算各个重复中有生活力的种子数，重复间最大容许差距不得超过表6-22的规定，平均百分率计算到最近似的整数。
在GB／t3543．1的结果报告单“其他测定项目”栏中要填报“四唑测定有生活力的种子______％”。
对豆类、棉籽和蕹菜等需增填“试验中发现的硬实百分率”，硬实百分率应包括在所填报有生活力种子的百分率中。
另外，种子生活力测定，还有甲烯蓝(MB)法、溴麝香草酚兰(BTB)法、红墨水染色法和软X射线造影法等。