康丽丽 周鸿飞(沈阳农业大学农学院)

玉米是一种重要的饲用、粮用和工业加工作物，在国民经济中占有重要的地位。玉米育种方法的改进对农业发展具有重要意义。长期以来，育种家们大多数是借用易于鉴别的形态学和同工酶等遗传标记来辅助育种，并取得了很大成功。但这类标记的最大不足之处在于其数量有限，要找到与目标性状密切相关的标记往往很困难，难以应用于育种实践。因此，育种家们一直希望能够找到一类数量丰富、选择效应高的标记，以提高育种效率和育种过程的预见性。随着分子生物学的发展，开发了基于DNA变异的分子标记。应用最广泛的主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP等，其中SSR标记是一种共显性标记，重复性好，可靠性高，分析简便，易于实现自动化，而且灵敏度高，检测遗传变异的能力强。近年来，SSR标记在玉米育种中得到了广泛的应用。

1 SSR标记

1．1 SSR标记的原理

简单重复序列(Simple sequence repeat.SSR)，又称为微卫DNA(Microsatellite DNA)。微卫星通常是指以2—4个核苷酸为单位多次串联重复的DNA序列，也有少数以l一6个核苷酸为串联重复单位。微卫星在基因组中的分布是随机的，它可以存在于内含子、外显子及染色体的其它任何区域。在不同植物中，微卫星重复单位的碱基组成及拷贝数随物种的不同而有所差异，但人们发现微卫星两端的序列是保守的。因此，可以设计出与微卫星两端保守序列互补的引物，通过PCR扩增重复序列本身并通过凝胶电泳检测其多态性。SSR序列多态性的出现是由于同一物种中不同基因型的寡核苷酸重复次数不同以及重复序列在染色体复制时的滑动或染色单体的不等交换造成的。因此，微卫星可用作分子标记。由于玉米中存在转座子，微卫星的多态性表现得极为丰富，所以，通过特异性引物进行PCR扩增反应、琼脂糖凝胶电泳(或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、放射自显影(或银染)和GeneScan技术等，就可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性，这也是SSR技术较其它几。种分子标记技术更适合于玉米研究的原因之一。

1．2 SSR标记的类型

按照重复单位的碱基数可将微卫星分为1～6核苷酸重复类型，其中二核苷酸重复有4种类型：(AT)n／(TA)n、(AG)n／(TC)n、(AC)n／(Gt)n、(GC)n／(CG)n；三核苷酸重复有10种类型：(AAT)n)/(TAT)n、(AAG)n／(TCT)n、(AAC)n／(TGT)n、(ATG)n／(TCA)n、(AGT)n／(TAC)n、(AGG)n／(TCC)n、(AGC)n／(TGC)n、(ACG)n／(TCG)n、(ACC)n／(TGG)n、(GGC)n／(CGC)n；四核苷酸重复类型有32种(Jurke，1995)。所有类型的微卫星中以单核苷酸重复和二核苷酸重复的微卫星在基因组中出现的频率最高。同一重复类型中不同的碱基重复多态性也不一致。

另外，Weber(1990)按照微卫星核心序列结构的不同将微卫星标记分为三种类型：(1)完全型(perfect)，指核心序列以不间断的重复方式构成的微卫星；(2)不完全型(imperfect)，指在微卫星的核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端的连续重复的核心序列重复次数大于3；(3)复合型(compound)，指两种或两种以上的串联核心序列由几个连续的非重复碱基分隔开，但各种连续性的核心序列重复次数不少于5。

1．3 SSR的功能

SSR在真核生物基因组中的功能一直存在争议。在植物基因组中，大多数串联重复序列是非编码的，所以长期以来人们一直认为SSR是一类“垃圾”DNA，是转录哑区，没有明确的生理功能。随着研究的深入，有关SSR功能的资料在不断积累。总的来说，SSR的功能主要有以下几个方面：有些SSR(通常为4～7个碱基重复型)存在于结构基因的转录区，并且编码氨基酸；染色体末端的SSR有保护DNA完整性，避免降解、融合及丢失的功能；位于DNA调控区的SSR有提高或降低临近基因转录速率的作用；SSR区可能是基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR具有产生转录启动复合物或活化染色体的功能。所以人们相信，尽管大多数SSR确实没有明确的生理功能，只是采取了某种策略来确保自身存活，但部分SSR序列确实是功能基因的一部分。

目前，已知至少有10种以上的人类遗传疾病都与微卫星序列的突变有关。在引起这些疾病的相关基因附近、内含子或外显子中，一般含有三核苷酸微卫星序列，其中患者中所携带的这些微卫星序列往往不稳定，而且长度通常比正常人的更长。在植物中也发现了一些性状与微卫星序列长度变化密切相关。例如，水稻6号染色体上的Wx基因编码一种淀粉合成酶，它与水稻胚乳中直链淀粉的合成有关。在Wx基因的5’非转录区有1个微卫星序列(CT)n，该序列的长度与不同品种的直链淀粉含量高低具有明显的相关性。一般认为，微卫星序列可能在基因的表达调控、染色体结构、染色体重组、新基因的起源及演化等方面有着重要的意义。

1．4 SSR标记的引物来源

微卫星DNA分析成功与否的关键因素有两个，一是PCR扩增的效果，另一个就是侧翼序列引物的来源。一般来说，微卫星扩增的引物来源有四个：一是直接应用已发表的微卫星DNA引物；二是使用近缘种的引物；三是通过筛选DNA序列数据库，或筛选克隆文库的简单重复DNA序列，借助于计算机软件进行引物设计；四是最好也是最根本的方法，即构建基因组文库，再根据微卫星位点两翼的序列来设计引物。

2玉米DNA指纹库的构建

2． 1利用SSR分子标记构建玉米DNA指纹库

目前，国内外对玉米种质鉴定采用的遗传标记仍以形态标记为主，参考同工酶和种子贮藏蛋白标记。但形态标记的表现受环境影响较大，鉴定工作量大，周期长，受季节限制。同工酶和种子贮藏蛋白标记多态性不够丰富，同工酶还存在组织和器官特异性，取材有严格的一致性要求，所以鉴定结果不够稳定。近年来发展较快的分子标记是以DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳定遗传，可反映生物的个体和群体特征。由于它直接反映DNA水平上的差异，具有高度的专一性和特异性，不同物种、同一物种不同品种所得DNA指纹各异，就像人类的指纹一样，成为当今最先进的指纹鉴定技术。一种理想的分子标记应具有以下特点：多态性高；重复性和稳定性好；带型清晰，容易统计；在染色体上均匀分布；中性；共显性；简单快速，易自动化；开发和使用成本低廉。DNA指纹技术的发展日新月异，除以Southern杂交为基础的RFLP外，近几年已发展出了多种以PCR为基础的新的DNA指纹技术，如RAPD、AFLP、SSR、SCAR和ISSR等及以单核苷酸多态性为基础的SNP技术。但是，不同分子标记的应用价值不同(袁力行等，2000；Saliba-(Mombani et a1.,2000)。RFLP技术多态性较低，遗传信息有限，需要的DNA模板量大，而且操作复杂。RAPD技术尽管具有简单易行、需DNA量少、自动化程度高和实验周期短的优点，但对反应条件较敏感，重复性差。AFLP具有多态性高和稳定性好的优点，但所需DNA模板量大，操作步骤复杂，同时它还是专利技术。与其他标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在DNA指纹库构建上显示了独特的优越性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量大；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享(李新海等，2000)。虽然SSR引物的开发费用相当高，但由于其巨大的应用潜力，在一些主要农作物中SSR引物的开发正在进行中。目前，在玉米上已公开的SSR引物序列已达1800多对，并且每隔一段时间就有新的引物增加，为该技术在玉米DNA指纹图谱中的应用提供了良好的条件。

2．2玉米DNA指纹库构建的意义及其作用

我国国家种质库目前已搜集整理玉米种质15967份，在生产上每年种植面积在5万亩以上的玉米杂交种约300个，已申请植物新品种保护的玉米杂交种和自交系1000多个，每年参加国家区试及各省市预试的品种数以千计，通过国家和各省市审定的品种数百个(孙世贤等，2005)。同时，由于少数骨干亲本的集中应用，玉米品种间的遗传差异越来越小，加之随着转基因等新技术在玉米育种中的应用，在原品种基础上仅改良少数甚至单个性状的依赖性派生品种将增多。上述诸方面因素使得完全根据形态性状进行玉米品种的辨别越来越困难，给品种资源的收集、整理、鉴定筛选及品种的选育、保护及玉米开发中的种子生产、经营、管理、维权等诸环节带来不同程度的困难。鉴于上述种种问题，急需从DNA分子水平给予每个玉米杂交种和自交系以一个能够准确表明其身份的身份证号码。与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，而且具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，这是品种鉴定实现产业化的前提，也是品种鉴定技术的发展趋势。

2．2．1玉米的品种鉴定及保护

在同一物种中的各个品种存在大量的多态性标记，某一品种具有区别于其他品种的独特标记即一些特异性DNA片段的组合就称为该品种的“指纹”，各品种的独特的指纹片段构成该物种的DNA指纹库，它具有类似于人的指纹那样的高度个体特异性和稳定性。DNA指纹库在作物育种中有着广泛应用：第一，每个品种DNA指纹差异可直接提供与目标性状有关的DNA水平的信息，避免了环境的干扰，从而能大大提高杂交种育种中对亲本及后代理想单株的选择效率；第二，通过检测品种是否具有该品种特有的标记指纹片段，可以有效地鉴定品种纯度与真伪以及用于新品种登记和品种知识产权保护等。在已有的DNA指纹技术和应用基础上进行我国玉米品种标准DNA指纹库构建的研究，这对保护玉米育成品种的知识产权和育种家的权益、提高种子市场的种子质量具有重要意义。

2．2．2纯度及真伪检测

在玉米杂交种生产与销售过程中，建立以质量检测为中心的良种繁育与种子管理体系，对稳定和推广优良品种起着重要作用。在国际标准及国家标准中，均采用种子纯度、净度、发芽率和水分4个质量特性来衡量种子质量并以此定级。在这4项指标中，尤以品种纯度为最重要。目前，我国玉米种子纯度鉴定仍以形态鉴定、幼苗鉴定和田间小区种植鉴定为主，辅以同工酶和蛋白质电泳技术。然而，玉米品种数量越来越多，种质基础却越来越狭窄，原有的检测方法已不能满足实际需要，实践中迫切需要开发新的检测技术。DNA指纹技术因其分辨率高、重复性好和简单快速等优点适应了这一需求。

2.2.3国家区试品种质量监控

DNA指纹技术在国家区试中主要应用于以下3个方面：

(1)供试组合的一致性检测。如果供试组合本身不具有一致性，就失去作为一个品种的最基本条件，不能称为一个品种，当然也就没有进行区试的必要。实践中，某些育种者为了尽快推出品种，可能用未完全纯合的早代系组配组合，这样的组合在若干性状上尚未稳定，不宜在生产中推广。如果能在区试之前或早期就将这类组合剔除，将减少许多不必要的工作，使有限的资源集中到有希望的组合上。利用形态性状检测因周期长(至少一个生长季)无法起到预控的作用，只有DNA指纹技术才可能做到这一点。

(2)监控组合在不同区试年份是否发生更换。实践中，某些育种者对第一年区试表现不是十分突出的组合，在第二年区试时用另一个组合代替。在很多情况下，两个组合具有一个共同亲本或亲缘关系较近，因此形态性状上差别不太明显，不易区别。如何防止这种情况发生，保证区试的公正性和严肃性，是区试工作中面临的重要问题之一。DNA指纹技术的高鉴别能力适应了这一需要。

(3)在区试的同时进行品种权测试。品种区域试验和品种权测试具有密切的联系，二者是相辅相成的。但目前国内现状是品种权测试与区域试验各自进行，互无关系，造成人力和物力的巨大浪费。一些专家提出应将二者有机结合，同时进行，使一套试验满足两个目标的要求(孙世贤等，2003)。但在具体工作中如何操作，仍是一个值得深入探讨的问题。利用DNA指纹技术进行区试品种的品种权测试提供了一个可行的实施方式。2002年初步构建了54份京津唐和黄淮海区试品种的DNA指纹图谱；2003年对进入第二年区试的11份京津唐和黄淮海区试品种进行了一致性检测，并对同一份品种两年区试的DNA指纹进行了比较(赵久然等，2003)。

3我国玉米DNA指纹库构建情况与应用前景

吴渝生等从96对SSR引物中筛选出24对多态性丰富的引物，建立了云南省大面积推广的3个玉米杂交种及其亲本的DNA指纹图谱。在此基础上结合统计学方法，将各杂交系的指纹图谱以“0”、“l”型数据描述，将指纹图谱数字化，使得指纹图谱分析简化明了。赵久然等从158个SSR引物中筛选出10个核心引物，建立了60个玉米自交系的指纹图谱。核心引物要求PIC值(多态信息含量)高，重复性好，核心引物的使用大大减少了引物合成及筛选的工作量，达到省时高效的要求。李小辉等仅用二三个筛选出的核心引物就区分了13个玉米杂交种。谭君等利用6对核心引物区分73份供试玉米自交系，建立了西南地区常用玉米自交系的DNA指纹图谱。

关于我国玉米DNA指纹库的构建，王凤格(2005)系统地提出了在构建之前和构建过程中需要解决的几个重要问题。其中：(1)选用品种材料要具有代表性、完备性、开放性、实用性等特点；(2)选用标记方法，即本文的SSR技术；(3)SSR技术体系的优化：即从DNA提取、PCR扩增及电泳检测等环节对SSR技术进行了全面优化；(4)选用哪些SSR引物，即核心引物的确定，是指多态性、稳定性和重复性等综合特性好并可作为初步研究优先选用的一套引物。

玉米新品种DNA指纹库的建立将成为一个平台，为玉米多个领域提供丰富的有价值的信息。首先，通过对玉米品种DNA指纹多态性的分析，可以对国内玉米品种资源的遗传多样性作出总体评价。其次，通过将待检品种与DNA指纹库的品种指纹进行比对，获得品种纯度和真伪信息，避免了以前那种针对一个或少数几个品种进行大量引物筛选的工作。还可应用于国家区试玉米品种的质量监控，国家区试品种是未来国家推广品种的主要来源，保证了这些品种的质量就等于从源头上解决了玉米品种的质量问题。此外，在玉米新品种保护工作中，可以代替形态鉴定进行品种特异性、一致性和稳定性测试(即DUS测试)，从而大大缩短DUS测试的时间。最后，该技术还可应用于玉米品种侵权案的司法鉴定，为有效地维护玉米育种者的品种权益提供强有力的工具。

4结束语

玉米基因组较其它禾谷类作物的基因组比较大，重复序列所占比重也较大。近年来，人们对重复区段长度多样性、存在状态的变化及其在细胞中的功能及性能进行探索和研究，丰富了分子生物学理论，在玉米遗传研究中得到快速应用，日见显示出优越性。目前，玉米上已经公布的SSR引物序列已达2000多对，而且每隔一段时间就有新的引物增加，而各个科研单位已经开始着手ESI、SSR的开发利用，作为一种以SSR多态性高为基础的标记，其应用范围将日益扩大。此外，作为继RFLP的第二代分子标记,SSR这种分子标记已取得了一定的成果，并展现出广阔的应用前景，如SSR在基因表达和染色体的组织化中的作用，玉米体外雄性单性生殖诱导的候选基因的鉴定等。

玉米是我国的主要粮食作物之一，加快玉米育种进程对于发展国民经济具有重要的意义。在玉米遗传育种领域，SSR标记还可以用于分析玉米自交系间的遗传多样性，划分杂种优势群；构建SSR遗传图谱，定位目的基因；鉴定杂交种纯度等等，从而为玉米育种提供了有力工具。从目前玉米育种的现状来看，SSR技术若与现有的育种程序相结合，必将大大加快育种进程，很可能成为玉米商业育种中最快取得经济效益的一种技术。